Ocena metodami in vitro szkodliwego działania biopaliwa II generacji otrzymanego w procesie transestryfikacji tłuszczów odpadowych

Kierownik projektu: dr Jolanta Skowroń

Streszczenie projektu:

Biopaliwa, to nazwa ogólna dla paliw stosowanych w transporcie, które są otrzymywane na skutek: chemicznej, fizycznej lub termicznej konwersji biomasy w samoistne paliwa lub dodatki do paliw konwencjonalnych, nazywane biokomponentami paliw mineralnych. Biopaliwa II generacji są otrzymywane z surowców nienadających się do spożycia przez ludzi i zwierzęta oraz/lub z substancji odpadowych. Do grupy tej należą również biopaliwa, które powstają na bazie olejów posmażalniczych.

Celem projektu była ocena metodami in vitro szkodliwego działania biopaliw II generacji produkowanych w procesie transestryfikacji tłuszczów odpadowych.

 W ramach projektu zrealizowano następujące cele szczegółowe:

-      przeprowadzono analizę parametrów fizykochemicznych badanych biopaliw, ich składu  z wykorzystaniem sprzężonych technik chromatografii gazowej z detekcją spektrometrii mas oraz wykonano analizę próbek powietrza pobranych podczas produkcji biopaliwa  z surowego oleju rzepakowego

-      wykonano badania in vitro na komórkach: nabłonka skóry ludzkiej wyprowadzonych  z nowotworu skóry (A431), nabłonka płuc pochodzenia nowotworowego (A549), prawidłowych ludzkich komórkach nabłonka oskrzelowego (BEAS-2B) oraz jajnika chomika chińskiego (CHO-9)

-      opracowano broszurę informacyjną pt. „Bezpieczne warunki produkcji i stosowania biopaliw II generacji produkowanych w procesie transestryfikacji tłuszczów odpadowych”

-      opracowano zalecenia do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na biopaliwa II generacji

-      przeprowadzono seminarium weryfikujące opracowane materiały

-      przygotowano publikacje upowszechniające wyniki realizacji projektu.

Badane biopaliwa II generacji otrzymano w reakcji transestryfikacji niskotemperaturowej w warunkach laboratoryjnych z: przeterminowanego oleju rzepakowego (BP I), tłuszczu zwierzęcego (BP II), posmażalniczego oleju roślinnego (BP III). Biopaliwo IV otrzymane w reakcji transestryfikacji surowego oleju rzepakowego uzyskano od producenta. Dla badanych biopaliw określono następujące parametry fizyczne: temperaturę zapłonu, temperaturę blokady zimnego filtra, lepkość dynamiczną, prędkość i siłę ścinania, wartość opałową oraz liczbę kwasową.

Badania identyfikacyjne składu czterech badanych biopaliw przeprowadzono z wykorzystaniem sprzężonych technik chromatografii gazowej z detekcją spektrometrii mas. Na podstawie sumarycznej powierzchni pików zidentyfikowanych estrów metylowych kwasów tłuszczowych w badanych biopaliwach stwierdzono, że największe stężenie estrów oznaczano  w biopaliwie II, czyli w biopaliwie otrzymanym z tłuszczu zwierzęcego. Oszacowano, że stężenia estrów kwasów tłuszczowych były mniejsze: w biopaliwie I otrzymanym z przeterminowanego oleju rzepakowego o 23%, w biopaliwie III otrzymanym z posmażalniczego oleju roślinnego o 30%, a biopaliwie IV otrzymanym z surowego oleju rzepakowego o 78%, w stosunku do biopaliwa II otrzymanego z odpadowego tłuszczu zwierzęcego (BP II > BP I > BP III > BP IV).

 Analiza próbek powietrza pobranych na stanowiskach pracy w zakładzie produkującym biopaliwa z surowego oleju rzepakowego wykazała, że podczas produkcji tego rodzaju biopaliwa nie występowały przekroczenia najwyższych dopuszczalnych stężeń (NDS) metanolu oraz wodorotlenku potasu. Nie zidentyfikowano również w powietrzu żadnych estrów kwasów tłuszczowych.

 Ocenę cytotoksycznego działania badanych biopaliw na ww. komórkach wykonano stosując test oceniający integralność błon komórkowych (test NRU) oraz aktywność metaboliczną komórek (test MTT). Dla każdego badanego biopaliwa obliczono wartości IC50 (stężenie zmniejszające żywotność komórek o 50% w porównaniu z kontrolą) stosując program komputerowy wykorzystujący interpolacje krzywymi (logistyka czteroparametrowa) GEN 5 (Bio-TEK Instruments, INC.). Ocenę statystyczną otrzymanych wyników przeprowadzono stosując jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA dla prób niezależnych. W porównaniach wielokrotnych dla efektów prostych stosowano poprawkę dla porównań wielokrotnych – Bonferroniego.

 Przy opracowywaniu danych dla średnich wartości IC50, gdy charakter zmiennych uniemożliwiał wykorzystanie analizy wariancji ANOVA zastosowano test Kruskala-Walisa oraz przeprowadzono porównania wielokrotne (tzw. testy post-hoc). Wyniki uznawano za istotnie różne statystycznie przy p < 0,05.

 Komórki narażano na frakcję biopaliw otrzymaną przez wytrząsanie każdego z biopaliw  z medium hodowlanego właściwego dla danej linii komórkowej w stosunku 3:1 (v/v) (roztwór wzorcowy). Analizie poddawano więc tę cześć biopaliw, która w wyniku wielogodzinnego wytrząsania była w stanie rozpuścić się lub ulec dyspersji w warstwie medium hodowlanego opartego na wodzie. Jest to powszechną praktyką przy ocenie substancji słabo rozpuszczalnych  i nierozpuszczalnych w wodzie.

 Stężenia estrów kwasów tłuszczowych w badanych biopaliwach znalazło odzwierciedlenie w wynikach testów NRU, MTT oraz średniej wartości IC50 (średnie stężenia zmniejszające żywotność komórek o 50% w porównaniu z kontrolą) uzyskanych na 4 modelach komórkowych.

 Biopaliwo II otrzymane z tłuszczu zwierzęcego i zawierające największe stężenie estrów metylowych kwasów tłuszczowych wykazywało najsilniejsze działanie cytotoksyczne na komórki: nowotworowe płuc A549, jajnika chomika chińskiego CHO-9 oraz nabłonka oskrzelowego BEAS-2B w teście NRU i MTT.

 Biopaliwo III będące produktem estryfikacji posmażalniczego oleju roślinnego wykazywało najsilniejsze działanie cytotoksyczne na komórki nabłonka skóry ludzkiej A431 w teście NRU oraz MTT. Na komórki płuc A549 w teście MTT oraz na komórki jajnika CHO-9 w teście MTT  i NRU biopaliwo III wykazywało działanie cytotoksyczne mniejsze od biopaliwa II, ale większe od pozostałych badanych biopaliw, tj. biopaliwa IV otrzymanego z surowego oleju rzepakowego oraz biopaliwa I otrzymanego z przeterminowanego oleju rzepakowego. Za toksyczność biopaliwa III na komórki skóry mogą odpowiadać zanieczyszczenia powstałe podczas używania oleju w procesach smażenia w gastronomii.

 Najsłabiej cytotoksycznie na komórki płuc A549 oraz komórki jajnika CHO-9 działało biopaliwo I będące mieszaniną estrów kwasów tłuszczowych otrzymanych w procesie estryfikacji oleju rzepakowego przeterminowanego, ale wykazywało się silniejszym działaniem cytotoksycznym na komórki BEAS-2B w teście MTT i NRU niż biopaliwo IV otrzymane z surowego oleju rzepakowego. Biopaliwo to działało również najsłabiej na komórki nabłonka skóry ludzkiej A431 w teście MTT oraz NRU.

 Biopaliwo IV, chociaż otrzymane z surowego oleju rzepakowego, czyli najmniej zanieczyszczonego surowca, w teście NRU wykazywało się silniejszym działaniem cytotoksycznym na komórki płuc A549 niż biopaliwo III otrzymane z posmażalniczego oleju roślinnego oraz silniejszym działaniem cytotoksycznym na komórki skóry A431 niż biopaliwo II. W teście MTT na komórkach skóry A431 biopaliwo IV działało słabiej cytotoksycznie niż biopaliwo II. Biopaliwo to działało najsłabiej cytotoksycznie na komórki ludzkiego nabłonka oskrzelowego BEAS-2B w teście NRU oraz MTT.

 Badane biopaliwa pod względem siły działania cytotoksycznego na 4 modele komórkowe można uszeregować następująco: BP II biopaliwo otrzymane z tłuszczu zwierzęcego > BP III biopaliwo otrzymane z posmażalniczego oleju roślinnego > BP I biopaliwo otrzymane z przeterminowanego oleju rzepakowego > BP IV biopaliwo otrzymane z surowego oleju rzepakowego.

 Zestawienie wartości IC50 dla poszczególnych biopaliw otrzymane w teście NRU oraz teście MTT wykazało, że komórki prawidłowego ludzkiego nabłonka oskrzelowego (BEAS-2B) były czulsze na działanie cytotoksyczne badanych biopaliw niż komórki jajnika chomika chińskiego CHO-9 oraz ludzkie komórki nowotworowe płuc A549.

 Średnia wartość IC50 dla badanych biopaliw ustalona w badaniach na 4 modelach komórkowych miała najmniejszą wartość dla biopaliwa II w teście MTT oraz NRU na komórkach  BEAS-2B, a największą wartość dla biopaliwa I w teście MTT na komórkach A341.

Projekt II.P.05. Porównanie średnich wartości IC50 otrzymanych dla badanych biopaliw na komórkach: skóry A431, nowotworowych płuc A549, jajnika CHO-9 oraz nabłonka oskrzelowego BEAS-2B w teście MTT oraz NRU;  p < 0,05

Opis:  Test MTT:

komórki A431: a – średnia wartość IC50 dla biopaliwa I jest istotnie większa od każdej z pozostałych średnich  (p < 0,02). Średnie dla biopaliw I, II i III nie różnią się miedzy sobą (p > 0,05);

komórki A549: b – średnie wartości IC50 dla biopaliwa II i III, nie różnią się między sobą i są istotnie mniejsze od średnich dla biopaliwa I i IV; c – średnia dla biopaliwa I jest istotnie większa od średniej dla biopaliwa IV;

komórki CHO: d – każda średnia wartość IC50 różni się z każdą inną (p < 0,0005);

komórki BEAS-2B: e – każda średnia wartość IC50 różni się statystycznie istotnie z każdą inną (p < 0,05).

Test NRU:

komórki A431: ze względu na duże zróżnicowanie wariancji zastosowano test T3 Dunnetta. W tym przypadku średnie nie różnią się statystycznie między sobą;

komórki A549: f – średnia wartość IC50 dla biopaliwa II jest istotnie mniejsza od średniej dla każdego innego biopaliwa; g – średnia wartość IC50 dla biopaliwa IV jest istotnie mniejsza od średnich dla biopaliwa I i III, te dwie ostatnie nie różnią się między sobą;

komórki CHO: h – średnie wartości IC50 dla biopaliwa I i IV nie różnią się między sobą (p = 0,158), są istotnie większe od średnich wartości IC50 dla biopaliwa II i III; i – średnie wartości IC50 dla biopaliwa II i III różnią się między sobą w sposób istotny statystycznie;

Komórki BEAS-2B: j – średnie wartości IC50 dla biopaliwa II i III nie różnią się między sobą (p = 0,999) i są istotnie mniejsze od średnich wartości IC50 dla biopaliwa I i IV (p < 0,0005); k – średnie wartości IC50 dla biopaliwa  I i IV różnią się między sobą statystycznie istotnie (p = 0,001)

 Analiza statystyczna średnich wartości IC₅₀ określonych w przeprowadzonych badaniach dla każdego testu, każdego rodzaju komórek i dla każdego biopaliwa wykazała, że średnia wartość IC₅₀ dla komórek nabłonka skóry A431 w teście MTT była istotnie większa od pozostałych. Natomiast w teście NRU średnie wartości IC₅₀ dla komórek jajnika chomika chińskiego CHO-9 i ludzkiego nabłonka oskrzelowego BEAS-2B były istotnie mniejsze od średnich wartości IC₅₀ ustalonych na komórkach nowotworowych płuc A549 oraz komórkach skóry A431. Średnie w parach nie różniły się między sobą (p < 0,05).

 Analiza statystyczna zależności wartości IC₅₀ otrzymanych dla wszystkich badanych biopaliw z rodzajem zastosowanego testu do oceny cytotoksyczności wykazała, że rodzaj zastosowanego testu nie miał wpływu na wartości IC₅₀, natomiast na tę wartość miał wpływ rodzaj zastosowanych do badań komórek (p < 0,05).

 Uzyskane wyniki badań wskazują na potencjalne zagrożenie związane z produkcją i stosowaniem biopaliw II generacji i uzasadniają podjęcie działań zmierzających do oceny i ograniczenia ryzyka związanego z narażeniem na biopaliwa na stanowiskach pracy.

 W ramach realizacji projektu opracowano broszurę informacyjną pt. „Bezpieczne warunki produkcji i stosowania biopaliw II generacji produkowanych w procesie transestryfikacji tłuszczów odpadowych” oraz „Zalecenia do oceny i ograniczania ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu na biopaliwa II generacji” przeznaczone do wprowadzenia na tematyczną stronę internetową CIOP-PIB. Broszura będzie przekazana Agencji Rynku Rolnego, Kasie Rolniczego Ubezpieczenia Społecznego oraz rolnikom indywidualnym.

 Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono w 4 publikacjach o zasięgu krajowym  i międzynarodowym oraz w postaci referatów na 2 konferencjach (Porto, Kielce).

„Zalecenia do oceny i ograniczania  ryzyka zawodowego dla pracujących w narażeniu  na biopaliwa II generacji” Autorzy: dr Jolanta Skowroń, dr Lidia Zapór, dr Katarzyna Miranowicz-Dzierżawska 2016 r.

Bezpieczne warunki produkcji i stosowania biopaliw II generacji produkowanych w procesie transestryfikacji tłuszczów odpadowych - J. Skowroń, L. Zapór, K. Miranowicz-Dzierżawska

W publikacji zebrano informacje opracowane na podstawie przeglądu piśmiennictwa światowego z ostatnich lat na temat produkcji i stosowania biopaliw jako działania proekologicznego. Zdefiniowano biopaliwa oraz wady i zalety ich stosowania. Omówiono zagrożenia dla zdrowia człowieka związane z ich produkcją i stosowaniem oraz działania i środki służące ograniczeniu do minimum narażenia na niebezpieczne substancje stosowane do ich produkcji, które należy przedsięwziąć. Publikacja jest przeznaczona dla producentów i użytkowników biopaliw ze szczególnym uwzględnieniem rolników indywidualnych. Format: A5 (14,5 x 20,5) Liczba stron: 27 ISBN: 978-83-7373-207-0 Rok wydania: 2016

Jednostka: Pracownia Toksykologii

Okres realizacji: 01.01.2014 – 31.12.2016